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高效液相色譜儀原理及操作步驟和注意事項【圖文】

高效液相色譜儀是是一種基于經(jīng)典液相色譜法，結合氣相色譜理論和實(shí)驗技術(shù)的新型液相色譜分析法，廣泛應用于藥物分析、環(huán)境檢測、食品安全及生化研究等領(lǐng)域。其核心原理是通過(guò)高壓驅動(dòng)流動(dòng)相攜帶樣品通過(guò)固定相色譜柱，利用各組分在兩相間分配系數的差異實(shí)現分離，并由檢測器定量分析。依利特為您整理HPLC的工作原理、標準化操作步驟及使用注意事項，確保實(shí)驗的準確性與儀器的高效運行。

高效液相色譜原理

高效液相色譜儀(HPLC)是應用高效液相色譜原理，主要用于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩定的和分子量大的有機化合物的儀器設備。它由儲液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相) 內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中做相對運動(dòng)時(shí)，經(jīng)過(guò)反復多次的吸附- 解吸的分配過(guò)程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內流出，通過(guò)檢測器時(shí)，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來(lái)。

高效液相色譜儀操作工序：

一：配置好實(shí)驗所需的流動(dòng)相(甲醇:水=8:2)和純甲醇，經(jīng)過(guò)濾超聲后備用。

二：打開(kāi)泵電源。將泵的壓力上限設置為40MPa。(已設定好，可不用再設定)

1.將泵的過(guò)濾頭輕輕放入到新配好的純甲醇中，設置流量為1ml,然后按“啟動(dòng)/停止”鍵開(kāi)始走液，經(jīng)過(guò)10-20分鐘后按“啟動(dòng)/停止”鍵停止走液。

2.將泵的過(guò)濾頭輕輕放入到新配好的甲醇水中，然后按“啟動(dòng)/停止”鍵開(kāi)始走液。

3.打開(kāi)檢測器電源，調整好檢測器的波長(cháng)280(已設定好，可不用再設定)，然后按“調零”鍵調零。

三：打開(kāi)電腦上的UC-3268色譜工作站，左上方出現握手圖標，說(shuō)明工作站已連接儀器。然后查看基線(xiàn)等基線(xiàn)走直即可進(jìn)樣。

四：進(jìn)樣之前先看基線(xiàn)在不在界面內，如果不在按“調零”鍵調零，之后再開(kāi)始進(jìn)標樣，將液體進(jìn)樣閥扳到“LOAD”位置，將標樣打入液體進(jìn)樣閥內，再把液體進(jìn)樣閥扳到“INJECT”位置,此時(shí)工作站已啟動(dòng)，等峰出完后點(diǎn)“停止”鍵。

五:做校正曲線(xiàn)

1.編輯定量參數點(diǎn)擊“定量參數”圖標，彈出方法編輯窗口：設置好“定量方式：（峰面積）”、“定量方法（外標法）”、“標準（1個(gè)濃度標樣，選‘1點(diǎn)’”）、“次方（1次）”、“標樣濃度單位（%）”、“樣品結果單位（%）”。

2.填寫(xiě)組份表

點(diǎn)擊“組份表”圖標，彈出方法編輯窗口，填入所分析的樣品組份名稱(chēng)（辣椒素）、保留時(shí)間（5.2分鐘左右）及標準濃度（100）。

3.定義校正曲線(xiàn)

點(diǎn)擊“校正曲線(xiàn)”圖標，彈出方法編輯窗口。定義各點(diǎn)對應的色譜峰文件。即先用鼠標指向標樣點(diǎn)號，然后單擊左鍵，則該點(diǎn)號被藍框覆蓋，再單擊右鍵，彈出右鍵可選菜單：

選擇“增加”項（此項操作即表示同一個(gè)濃度點(diǎn)，可以加入幾個(gè)平行實(shí)驗的數據進(jìn)來(lái)進(jìn)行平均計算），彈出“譜圖選擇”窗口。然后在此選擇相應的譜圖文件，則該序號點(diǎn)的文件前出現一個(gè)“+”號。各個(gè)點(diǎn)定義完成后，單擊“重校正”即可顯示出校正曲線(xiàn)。點(diǎn)“確認”鍵。

六:進(jìn)樣品，出完峰后點(diǎn)停止，點(diǎn)屏幕報告即可查看結果。如有多個(gè)樣品，可重復 進(jìn)樣品 此步驟即可。

七:查看以前樣品結果

進(jìn)入“再處理”界面，點(diǎn)擊“打開(kāi)數據文件”圖標，彈出“譜圖選擇”窗口在此選擇樣品譜圖文件，如下：

然后要單擊“重新計算”按鈕，再點(diǎn)擊“屏幕報告”圖標，即可看到屏幕報告表：

八:關(guān)機

關(guān)閉檢測器電源，按“啟動(dòng)/停止”鍵停止泵運行，將泵的過(guò)濾頭輕輕放入到新配好的純甲醇中，按“啟動(dòng)/停止”鍵開(kāi)始走液，經(jīng)過(guò)10-20分鐘，泵壓力穩定后，按“啟動(dòng)/停止”鍵停止走液，關(guān)閉泵電源。電腦不用可提前關(guān)閉。

液相色譜儀結構:

1、溶劑輸送系統；儲液器，用來(lái)貯存數量足夠、符合要求的流動(dòng)相。配有溶劑過(guò)濾器，以防止流動(dòng)相中的顆粒進(jìn)入泵內。脫氣器，脫氣的目的是為了防止流動(dòng)相從色譜柱內流出時(shí)釋放出氣泡進(jìn)入檢測器，從而引起噪聲，不能正常檢測。

輸液泵，將儲液器中的流動(dòng)相連續不斷地以高壓形式進(jìn)入液路系統，使樣品在色譜柱中完成分離過(guò)程。梯度洗脫裝置，是在分離過(guò)程中通過(guò)逐漸改變流動(dòng)相的組成增加洗脫能力的一種裝置。

2、進(jìn)樣系統；進(jìn)樣器：是將樣品送入色譜柱的裝置，進(jìn)樣方式可以分為兩種：閥進(jìn)樣或自動(dòng)進(jìn)樣。比較常用的是采用自動(dòng)進(jìn)樣器裝樣。

3、分離系統；色譜柱：對樣品進(jìn)行分離，是整個(gè)色譜系統的心臟，它的質(zhì)量?jì)?yōu)劣直接影響到分離的效果。

4、檢測系統；檢測器：將色譜柱連續流出的樣品組分轉變成易于測量的電信號，被數據系統接收，得到樣品分離的色譜圖。

5、數據處理和記錄系統；對色譜數據進(jìn)行處理，并參與HPLC儀器的自動(dòng)控制。

液相色譜儀注意事項：

1、泵正常工作時(shí)，在流動(dòng)相和流速不變的前提下柱壓應該是穩定的，當然在換流動(dòng)相時(shí)壓力變化是正常的，正常情況下如果柱壓升高基本上都是由色譜柱使用時(shí)間長(cháng)引起的（只有更換色譜柱），如果正常情況下壓力突然降低有可能是（1）接頭處有漏液的地方，采取的方法是有濾紙檢查，如有漏液的地方用扳手擰緊即可。如果沒(méi)有漏液則可能是（2）白色的管子里面有氣泡從而導致流動(dòng)相進(jìn)不到泵里面去，采取的方法是排氣泡。排氣時(shí):先STOP停泵--打開(kāi)排氣閥--按PURGE（快沖）鍵--等氣泡排完后先STOP停泵--擰緊排氣閥，其先后步驟不要搞反了。

2、泵正常工作時(shí)最高壓力最好不要超過(guò)200KG，所以打開(kāi)泵以后可以將泵的zui大壓力調到200KG，這樣如果壓力超過(guò)上限則會(huì )自動(dòng)報警停機，流速zui好不用超過(guò)1ML/MIN，如果使用時(shí)壓力超過(guò)200KG，建議將流速調低點(diǎn)以降低壓力（在色譜柱正常的情況下），如果是因為色譜柱長(cháng)時(shí)間使用造成壓力升高則建議更換色譜柱（因為色譜柱屬于耗材長(cháng)時(shí)間使用就需要更換，更換的主要依據色譜柱出峰不正?；蛘咧鶋毫^(guò)高）。

3、泵正常工作時(shí)平均每15天左右向注油孔加潤滑油2-3滴。

4、流動(dòng)相里面如果有鹽或酸類(lèi)，做完實(shí)驗后要先用95%二次蒸餾水與5%甲醇洗色譜柱40分鐘左右，然后用純甲醇洗30分鐘左右才可以關(guān)機。第二天如果繼續做實(shí)驗流動(dòng)相里面仍舊有鹽或酸類(lèi)，zui好先用95%二次蒸餾水與5%甲醇過(guò)渡20分鐘，再用流動(dòng)相。如果流動(dòng)相里面只有甲醇，水，乙腈，做完實(shí)驗后就不用95%二次蒸餾水5%甲醇沖洗，可直接用純甲醇洗30分鐘即可關(guān)機。

5、色譜柱的耐酸PH值范圍3-8使用時(shí)不要超出。

6、儀器長(cháng)期不用時(shí)一定要將濾頭泡在甲醇里半月開(kāi)機一次，如果開(kāi)機時(shí)泵抽不上液可以打開(kāi)排氣閥按PURGE快沖。

7、調反壓器時(shí)要注意等液體流出來(lái)以后才能調，一般調8--10KG，比如現在泵顯示屏顯示柱壓50KG那再增加10KG顯示屏上顯示柱壓60KG然后擰緊鎖緊螺母。

8、關(guān)機順序：清洗液路時(shí)可以把檢測器直接關(guān)機，清洗結束后先按STOP讓泵停止后再關(guān)電源，不允許直接關(guān)機

依利特30年來(lái)始終專(zhuān)注于色譜技術(shù)的研發(fā)與應用，構建了涵蓋“實(shí)驗室理化分析、新興生物技術(shù)上游純化、臨床分析檢測”三位一體的業(yè)務(wù)布局。其產(chǎn)品線(xiàn)廣泛覆蓋實(shí)驗室分析、生物制藥純化及臨床檢測等領(lǐng)域，包括1100/3100/3200/3200L系列高效液相色譜儀、色譜工作站軟件、MS2 Vertical 9100三重四極桿質(zhì)譜儀、氣相色譜儀、制備純化色譜系統、計量泵、色譜柱及其配件等核心產(chǎn)品。經(jīng)過(guò)三十年的技術(shù)積累，公司持續深化色譜技術(shù)在各領(lǐng)域的應用，推動(dòng)分析檢測與純化技術(shù)的創(chuàng )新發(fā)展。